重庆医科大学挑战HBV cccDNA检测世界级难题

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HBV cccDNA之数字PCR检测

数字PCR在病毒核酸检测中的定位：能够实现复杂来源样品中极低含量核酸（DNA或RNA）稳定检出的一种基于PCR的绝对定量技术。

根据目前学术界的具体应用，可以大致进行如下分类。所谓“复杂样品”大体可以分为：临床样品和环境样品（如水样、土壤等等）。在临床样品中，按病毒种类分，欧美科学家大多聚焦于HIV相关的核酸检测。作为一个乙肝高发国家，中国科学家则努力尝试将ddPCR应用于HBV相关的核酸检测。本期介绍由重庆医科大学第二附属医院肝病研究所廖勇老师实验室完成的工作，该研究尝试采用ddPCR技术对极低含量的乙肝病毒cccDNA进行检测。





HBV cccDNA研究的重要性


HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）是HBV复制的初始模板。在HBV感染的肝细胞细胞核内持续、稳定地存在，被认为是HBV感染慢性化及抗HBV治疗停止后复发的最主要原因。cccDNA是嗜肝DNA病毒在肝内进行复制的原始模板，虽然含量少，但对病毒在宿主细胞内感染状态的建立以及维持病毒在细胞内的复制过程具有十分重要的意义。与rcDNA不同，cccDNA位于宿主肝细胞的细胞核而非细胞浆中。

嗜肝DNA的病毒基因组是一种松弛环状的双链DNA（relaxed circular DNA, rcDNA）分子，其两条链均不闭合，其中负链较长。在病毒复制过程中，病毒DNA进入宿主细胞核，两条链的缺口均被补齐，形成超螺旋cccDNA分子，在电镜下证实为大小约3.2kb的超螺旋DNA分子。

当前慢性乙型肝炎抗病毒治疗难以彻底清除病毒，皆因cccDNA不能被彻底清除。只有清除肝细胞核内HBV cccDNA，才有望实现彻底治愈慢性乙型肝炎。近年来，随着以实时荧光定量PCR技术为代表的检测技术日渐成熟，以及临床医生对cccDNA检测临床意义认识的不断提高，cccDNA检测已从基础研究逐渐进入到临床应用。

HBV cccDNA检测的难点

存在大量与cccDNA序列同源性较高的其他形式的HBV DNA。包括：成熟病毒颗粒中的松弛、环状、双链DNA（relaxed circular DNA, rcDNA）分子；部分病毒颗粒中存在的双链线性DNA（double-strand linear DNA, dsDNA）分子；由前基因组RNA（pregenomic RNA, pgRNA）逆转录形成的单链DNA（single-stranded DNA，ssDNA）。

cccDNA含量少，仅存在于肝细胞的细胞核内，约为30~50 copies/cell。在接受抗病毒治疗的情况下含量更低。

检测样品有限，目前最可靠的cccDNA检测标本是肝脏组织。

[/ol]研究目的：采用基于绝对定量的ddPCR对HBV cccDNA进行检测，验证该技术在临床应用的可行性。

测试对象：ATCC的HepG2.215细胞系和pcDNA3.1-HBV1.3质粒。经过核酸纯化后，前者建立梯度如下：200, 100, 50, 10, and 1 ng/ul；后者梯度稀释如下：10^-5~10^0 pg/ul （an equivalent of 10^0~10^5 copies/ul）。

方法与平台：Bio-Rad QX100 droplet digital PCR System和Bio-Rad CFX96 Touch Real-time PCR System。两组不同的TaqMan Assay设计思路，一种是专门针对cccDNA序列设计；一种是针对HBV DNA保守区域设计。前者只能特定检测cccDNA；后者能检测所有的HBV序列。

测试的不同条件：

PSAD（Plasmid-safe ATP-dependent deoxynuclease，能降解除去非环状结构的HBV DNA）处理与不处理情况下的ddPCR结果。

cccDNA特异性assay与HBV通用型assay。

[/ol]ddPCR的检测灵敏度：以10^-5~10^0 pg/ul的pcDNA3.1-HBV1.3质粒为检测对象，ddPCR的检测灵敏度可达单拷贝。且在上述浓度范围内，实际检测得到的拷贝数与理论值一致。具体结果见下图。



PSAD处理对检测结果的影响：PSAD处理能有效去除非环状结构的HBV DNA分子，显著降低ddPCR测得的绝对拷贝数，更好地反应HBV cccDNA的真实拷贝数。具体结果见下图。



cccDNA特异性assay与HBV通用型assay的ddPCR结果：cccDNA的ddPCR检测结果表明，cccDNA特异性assay较HBV通用型assay，能更特异性地进行HBV cccDNA的检测，并且经过PSAD处理后能进一步提高检测的特异性。具体结果见下图。



ddPCR与QPCR结果比较：以cccDNA特异性assay对200, 100, 50, 10, and 1 ng/ul梯度稀释的HepG2.215细胞系DNA进行分析，QPCR实现有效检出的最低含量为50ng的HepG2.215细胞系DNA，而ddPCR仅为1ng。具体结果见下图。




总体结论

相较于传统的荧光定量PCR，基于ddPCR的核酸检测能够对HBV cccDNA实现更灵敏、更准确的定量，有望在临床上实现对慢性肝炎病人组织样品的检测及后续抗病毒治疗的疗效评估。

上述不同测试条件下计算得到的cccDNA拷贝数见下表汇总。具体实验方案上，采用cccDNA特异性检测assay并结合样品的PSAD前处理结果最佳。


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“下期预告”

FFPE样品中HBV DNA的数字PCR检测


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